MICROSCOPÍA
ELECTRÓNICA
David
Vaíllo García
El procesamiento se va a llevar a cabo en 3 días, realizando previamente la fijación y el tallado.
Preparación del fijador primario:
- Composición del fijador: Glutaraldehido
al 2.5% en tampón fosfato:
Tampón fosfato
………….………………………………………........................... 25 mL
Glutaraldehido de 25% (tal como
viene envasado en la ampolla) … 1 mL
- Preparación del tampón fosfato
(Millonig, 1964; Karlson y Shultz, 1965)
Fosfato sódico monohidratado (NaH2PO4.
H2O) …………………. 0.450 gr
Fosfato disódico 7hidrato (NaHPO4.
7H2O) …………………...…… 5.812 gr
Cloruro sódico (ClNa)
………………………………………….............….. 1.250 gr
Agua bidestilada
……………………………………...............…………….. 250 mL
El pH del tampón: 7.4. El pH del tampón del fijador
no es tan crítico como la osmolaridad en el fijador primario, para una buena
fijación. Con un pH de 6.5 a 8 se obtienen los mismos resultados. El control de
calidad del pH necesita un pH-metro.
Osmolaridad del tampón: 384 mosmoles. El control de calidad
precisa un osmómetro.
Conservación del
tampón: En nevera a
4Cº. Renovarlo cada semana (se contamina).
Tallado de microbloques:
Sobre
una tarjeta de cartulina se depositan unas gotas de tampón y con la pieza
sumergida en el mismo se corta por deslizamiento (no por presión) con dos
cuchillas de afeitar paralelas. Se obtienen microbloques prismáticos de 0.5 X
0.5 X 1 mm.
Se
seleccionan 4 microbloques que sean los incluidos en plástico. Si se tallan
microbloques alargados es más fácil su orientación posterior.
Los
microbloques seleccionados no deben comprender zonas superficiales de la pieza,
que suelen estar alteradas por la manipulación.
Lavado:
Se
sustituye el fijador por tampón solo, dejando los tubos de vidrio en la nevera a
4Cº, hasta su inclusión en plástico, un mínimo de 24 horas y un máximo de 2
semanas.
Si
se hace la inclusión dentro de los 7 primeros días los resultados son buenos.
Si se transcurren las 2 semanas citadas
no se ha podido hacer la inclusión, no se desechan las piezas, ya que
aunque estén en malas condiciones pueden ser útiles para el diagnóstico.
El
buffer será el mismo que ha sido vehículo del glutaraldehido. Si no se elimina
completamente el glutaraldehido se puede producir posteriormente precipitados
de osmio reducido.
(Una vez
iniciada esta fase no debe de interrumpirse el proceso hasta el final de la
inclusión)
Fijación
secundaria o post-fijación
Composición del fijador: tetróxido de osmio al 2% tamponado
Tampón.…………………………………………………………................... 1
parte
Tetróxido de osmio al 4% en agua
bidestilada…………………. 1 parte
Preparación de la solución de osmio:
En un fraso topacio de tapón
hermético (u.g., los de las resinas perfectamente limpios-acetona, enjuagado,
lavajillas con limpieza química, calarado en agua bidestilada) se introduce la
ampolla del tertóxido de osmio desprovista de su etiqueta, lavada y rota. El
frasco contendrá previamente el agua bidestilada en cantidad apropiada.
La
disolución es lenta, por ello se prepara como mínimo 24 horas antes de su
utilización y se conserva en la nevera a 4Cº revistiendo completamente el
frasco con el papel de aluminio para que no penetre la luz.
El tapón se
añade en el momento de utilizar el fijador.
Duración de la fijación: 90 minutos. En nevera a 4Cº.
Envoltura de papel de aluminio.
Recipientes para las muestras
durante la fijación:
se logra una mayor comodidad que con pesafiltros o pocillos, introduciendo las
muestras en capsulas porosas con tapón y estas en un soporte que se introduce
en un vaso de precipitados con el fijador. El mismo soporte servirá para la
deshidratación.
Aditivos para el fijador: la adición de iones calcio inhibe la
formación de figuras melínicas y favorece la acción del tetróxido de osmio, por
lo que se utiliza con este tipo de fijadores. Se recomienda a una concentración
de 0.005M, añadiendo 1 mL de solución de cloruro cálcico (CaCl2. 6H2O)
por cada 100 mL de fijador. Solución stock de calcio: 10 gr de cloruro cálcico
más 1000 mL de agua bidestilada.
Lavado en
tampón: 20 minutos. Hacer el cambio con gafas antigas y ventilador.
Deshidratación con acetona
(intercalando
tinción con acetato de uranilo)
Consiste
en la sustitución de la fase acuosa del tejido por otro disolvente (acetona).
La acetona debe de ser de la máxima calidad (tipo p.A. –para análisis)
El
etanol no es adecuado, ya que con el osmio puede producir un precipitado que no
aparee con la acetona. Además la acetona, elimina rápidamente las sales del tampón,
lo que es importantísimo, ya que el acetato de uranilo reacciona con los
tampones fosfatos.
Pasos en la deshidratación:
-1. Acetona
de 35%, 3 pasos de 10 minutos cada uno.
-2. Acetona
de 50%, 3 pasos de 10 minutos cada uno.
-3. Acetona
de 70%, 3 pasos de 10 minutos cada uno.
-4. Acetato
de uranilo al 2% en acetona de 70%
Duración de la tinción con acetato
de uranilo: 24
horas en nevera.
Es
importante que el recipiente este revestido con papel de aluminio y guardarlo
rápidamente en la nevera, ya que la solución de uranilo precipita rápidamente
bajo el efecto de la luz.
El
acetato de uranilo se prepara en el momento de su utilización y se filtras con
3 papeles de filtro superpuestos.
El
uranilo tiñe ácidos nucleicos, ribosomas, membranas, glucógeno y débilmente
proteínas y lípidos.
SEGUNDO DÍA
-5. Acetona
de 90%, 3 pasos de 20 minutos cada uno.
Se recupera
a partir del 2º paso para limpieza de material.
En este
tiempo se prepara en una estufa a 50Cº: una probeta de 100 mL, un vaso de precipitados
de 250 mL y una varilla de vidrio, material necesario para los pasos con los
plásticos.
-6. Acetona
sin diluir, 2 pasos de 20 minutos cada uno.
-7. Acetona
deshidratada, 3 pasos de 20 minutos cada uno. La acetona se prepara con días de
antelación añadiendo a 1000 mL de acetona sin diluir unos 50 mL de polvo de
sulfato de cobre, con elo sobra mucho sulfato para saturar la acetona.
-8. Óxido
de propileno, 2 pasos de 30 minutos cada uno.
Al ser
miscible con la acetona y con el plástico facilita su penetración en las
muestras.
A los 15
minutos del primer paso se empieza a preparar la “araldita I”.
Inclusión en el plástico o resina:
Utilizamos
como plástico la araldita, polímero de tipo epoxi que al igual que el epon pose
puentes transversales. Los epóxidos han sustituido para este fin a los
metacrilatos. Los cortes con epon son más hidrófilos, que los incluidos en
araldita y dan mejores resultado en tejidos vegetales, bacterias y hongos.
Propiedades
de la araldita:
Presentación comercial: líquidos, en frascos de 100 mL. Una
vez abiertos conservar en la nevera a 4Cº. Consta de 4 componentes:
-
Componente A/M (resina epoxi) del Durcupan-ACM de “Fluka”.
-
Componente B (endurecedor 964) del Durcupan-ACM de “Fluka”.
-
Componente C (acelerador 964) del Durcupan-ACM de “Fluka”.
-
Componente D (plastificante) del Durcupan-ACM de “Fluka”.
Peligrosidad: la araldita puede ser irritante
para la piel y producir dermatitis en personas sensibles.
“Araldita
I“y “araldita II”: Denominamos así a determinadas mezclas de los componentes
mencionadas, que son los que utilizaremos durante la inclusión. Las mezclas se
hacen con el material de vidrio ya mencionado que estará calentado a 50Cº,
adicionando los diferentes componentes en el orden y cantidades siguientes:
“Araldita
I”:
- Componente B
(endurecedor)…………………40 mL. Probeta de precipitados
- Componente A/M
(resina)……………………..40 mL. Con la misma probeta
- Componente D
(plastificante)…………………0.6 mL. Pipeta
“Araldita
II”:
A los componentes de la “araldita I”
en las cantidades señaladas en el apartado anterior se añaden 1.6 mL del componente C (acelerador). Agitar
con la varilla de vidrio, no con la pipeta.
Precauciones a tomar para hacer las
mezclas: Los
componentes A/M, B y D para hacer la “araldita I”, se pasan de la nevera a la
estufa de 50Cº media hora antes de su uso para que se fluidifiquen. El material
de vidrio se limpia en un ultra sonador con la acetona recuperada a partir de
100%, limpieza química en lavajillas. La araldita no utilizada se desecha en
frascos.
Pasos en la inclusión en araldita: Son los pasos siguientes:
-1. Óxido
de propileno + “araldita I”: aa. 2 horas a 50Cº.
-2.
“Araldita I” 24 horas a 50Cº.
TERCER DÍA
-3.
“Araldita II”. 2 horas a 50Cº. Se prepara 30 minutos antes de usarla.
-4. Inclusión
definitiva de los bloques en “araldita II”. Cápsulas de Beem o moldes de
silicona.
-5.
Polimerización en estufa a 70Cº, dos días.
Cortes de control (semifinos o de 1
micra)
Utilidad: Sirven para seleccionar las zonas
que han de ser cortadas para su estudio directo en el microscopio electrónico y
para tener un control de microscopía
óptica. Al eliminar la realización de cortes ultrafinos, que sería
infructuosos, supones un gran abaratamiento de los cortes en el laboratorio de
ME.
Método: Utilizamos un método original con
etil-metilato sódico como desplastificante que, se evita el gran peligro de
incendio en el laboratorio la manipulación de sodio metálico, inflamable al
contacto con el agua. Además con este método los cortes no se despegan, el
fondo es mucho más limpio, la diferenciación es fácil y no se utiliza acetona
sino etanol que es menos tóxico.
Preparación del etil-metilato
sódico:
a) Disolver
con agitación continua:
- Hidróxido sódico (NaOH) en
lentejas (cuidado quema)………… 25 gr
- Alcohol absoluto
p.A.……………………….…………................………... 250 mL
Tarda horas
en disolverse. Dejar reposar 24 horas y filtrar. Frasco.
b) Reponer
las pérdidas con alcohol absoluto hasta 250 mL y añadir:
- Toluol p.A…………………………………………………….....................…...
500 mL
- Metanol p.A………………………………………………….....................……
250 mL
La solución
final toma color ámbar. Frasco topacio.
Limpieza de los portaobjetos: Es fundamental para que no se
despeguen los cortes.
- Mezcla crómico, 24 horas.
- Aclarar abundantemente al grifo.
- En ultra sonador con acetona, 1
hora.
- En ultra sonador con alcohol-éter,
1 hora.
Guardar los
portaobejtos limpios en alcohol-éter hasta su utilización.
Pasos en la tinción de los cortes
semifinos:
-1. Pegado
de los cortes semifinos al portaobjetos
- Poner sobre el portaobjetos unas
gotas de: 50 mL de agua destilada + 1 gr de gelatina en polvo.
- Depositar los cortes semifinos
sobre la gelatina e introducir el portaobjetos en una placa petri a los vapores
de toluol, sobre una placa térmica a 50Cº con ello se consigue que los cortes
se estiren.
- Secar y adherir los cortes
presionando con un papel de fumar sobre los mismos.
- Poner los cortes en estufa a 50
Cº, 24 horas antes de ser utilizados.
-2.
Desplastificación con etil-metilato sódico, 5 minutos, sin agitar.
-3. Alcohol
absoluto p.A., 3 pases de 5 minutos.
-4. Agua
bidestilada, 3 pases de 5 minutos.
-5. Teñir
durante 45 minutos, en estufa a 50Cº en una solución recién preparada y
filtrada de:
- Agua destilada……………………………………..……..........… 200
mL
- Carbonato sódico anhídro (Na2CO3)…….………………..
2.5 gr
- Azul de toluidina “0” (C15H16CN3S)…………..…………..
0.1 gr
Utilizar la
solución parra dos procesos de tinción como máximo.
-6. Alcohol
absoluto (imprescindible de tipo p.A.) xilol, montar en eukitt o similar.
Cortes ultrafinos:
Sobre las cuchillas:
-1.
Cuchillas de diamante: Útiles para materiales duros (dientes, hueso) y para grades superficies. Limpiar solo con
etanol. Los cortes se pueden estirar con unas gotas de etanol en la balsa. No
usar otros disolventes para limpieza ni para estirar los cortes ya que puede
perjudicar la fijación del diamante a su soporte. No debe utilizarse para todo
tipo de cortes, puesto que tienen una duración limitada por deterioro y un
precio elevado.
-2.
Cuchillas de vidrio: Conviene la utilización de “TUFTs” para hacer las balsas,
sellándolas con cera de dentista. La balseta se llena con agua bidestilada
hervida, ya que debemos tener presente, a partir de este momento que, la mayor
parte de las contaminaciones se producen en la “fase de rejilla”. Para enrasar
el agua de la balsa, el exceso de agua puede absorberse con un papel de fumar.
La
superficie aproximada de corte es de 0.02 mm2.
El
espesor del corte se comprueba teniendo en cuenta su color de interferencia,
que es un efecto semejante al que produce una película de aceite sobre el agua.
Los cortes de 60 a 90 nm de espesor son
los adecuados para estudiarlos con el MET y poseen un color plateado.
Los
cortes recién hechos sufren una compresión de un 10-15 % de la dimensión
perpendicular al filo de la cuchilla. Pueden estirarse pasando sobre los cortes
un pequeño fragmento triangular de papel de filtro humedecido con toluol.
Defectos más usuales de los cortes:
- Cortes de espesor variable/
corrientes de aire en la habitación/ se recomienda un habitáculo por
ultramicrotomo.
- Estrías/ filo deficiente/ cambiar
la cuchilla.
- Ondas/ velocidad de corte
inadecuada, ángulo de corte en la cuchilla inadecuado, ángulo libre de corte
inadecuado, superficie de corte demasiado grande/ velocidad de 3mm/seg, ángulo
de corte 45º, ángulo libre 3º.
Sobre las rejillas: Las más utilizadas son las de cobre, de
200 MESH (200 barras por pulgadas).
Limpieza de rejillas: En un psafiltros se hacen 3 pases
de 10 minutos cada uno con alcohol absoluto p.A. Después se dejan secar sobre
papel de filtro en una cápsula de petri.
Contrastado (o tinción) de las
cortes ultrafinos con plomo:
Preparación
de la solución de plomo (citrato de plomo) Reynolds:
-
Citrato trisódico 2-hidrato (C6H5Na3O7.
2H2O)…………........……… 1.76 gr
-
Nitrato de plomo (II) (Pb(NO3)2)…………………………...............……..
1.33 gr
-
Agua bidestilada libre de dióxido de carbono hervida…………….... 30 mL
Agitar
vigorosamente en matraz con tapón de vidrio esmerilado, durante 30 minutos y
durante la agitación se va añadiendo gota a gota una solución de hidróxido
sódico 1N hasta que desaparezca la apariencia lechosa de la solución.
Tras
la agitación se comprueba el pH, ajustando a pH12 con la misma solución de
NaOH. La solución se conserva durante meses en la nevera. Nosotros lo renovamos
cada 2 semanas.
El
agua bidestilada con segunda condensación en fragmentos de vidrio, es la más
idónea. Hay que evitar el agua deshionizada ya que las resinas de los filtros añaden un contaminante
orgánico. El reservorio del agua debe de ser de vidrio, ya que lo s plásticos
pueden liberar partículas contaminantes.
Pasos en el
contrastado con el plomo:
centrifugar el citrato de Pb, tapado, 20 minutos.
-1. Se
depositan en el fondo de una placa de petri revestido con parafina, gotas de
citrato de plomo. La superficie de los cortes en contacto con el líquido, 40
minutos. En la placa petri previamente se ha depositado lentejas de hidróxido
sódico sobre la parafina, formando una circunferencia.
-2. Hacer
7-10 inmersiones rápidas en un pocillo con hidróxido sódico 0.01 M
(“titrisol”) y otras 7-10 inmersiones respectivamente en toros dos pocillos con agua bidestilada hervida y enfriada inmediatamente antes de su uso.
(“titrisol”) y otras 7-10 inmersiones respectivamente en toros dos pocillos con agua bidestilada hervida y enfriada inmediatamente antes de su uso.
El contrastado se hace en campana de gases o con dispositivos que eviten que
dióxido de carbono ambiental (v.g., el espirado por el propio técnico de
laboratorio de ME) entre en contacto con el plomo de la rejilla, ya que se
formaran precipitados de carbono de plomo, una de las contaminaciones más
frecuentes en las rejillas. Este problema puede eliminarse con la utilización
de aparatos teñidores.
Estructuras que tiñe el plomo: tiñe fuertemente el glucógeno y las
membranas.
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